Moko Apt

Menebar Ilmu Pengetahuan

Konsep Dasar Polymerase Chain Reaction (PCR)

Leave a comment


download

Kary Mulis (1944- )

Polymerase chain reaction (PCR) atau reaksi berantai polimerase adalah teknik yang digunakan di laboratorium untuk membuat jutaan salinan bagian tertentu dari DNA. Teknik ini pertama kali dikembangkan pada 1983 oleh ahli biokimia Amerika, Kary Mullis. Dia dianugerahi Penghargaan Nobel dalam bidang Kimia pada tahun 1993 untuk karya rintisannya.

PCR adalah alat yang biasa digunakan di laboratorium penelitian medis dan biologi. Hal ini digunakan pada tahap awal pengolahan DNA untuk sequencing (penentuan urutan DNA), untuk mendeteksi ada atau tidak adanya gen untuk membantu mengidentifikasi patogen selama infeksi, dan saat membuat profil DNA forensik dari sampel kecil DNA.

PCR digunakan dalam biologi molekuler untuk membuat banyak salinan (amplify, memperkuat) bagian kecil dari DNA atau gen. Dengan PCR memungkinkan untuk menghasilkan ribuan sampai jutaan salinan bagian tertentu dari DNA dari jumlah yang sangat kecil dari DNA.

Bagaimana prinsip kerja PCR?

Lima bahan inti yang diperlukan untuk menjalankan PCR:

  1. template DNA yang akan disalin
  2. primer, potongan pendek DNA yang memulai reaksi PCR, yang dirancang untuk mengikat kedua sisi bagian dari DNA yang ingin disalin
  3. basa DNA nukleotida (juga dikenal sebagai dNTP). Basa DNA (A, C, G dan T) adalah bahan baku bangunan DNA dan diperlukan untuk membangun untai baru DNA
  4. enzim polimerase Taq, untuk menambahkan dalam basa DNA baru
  5. larutan penyangga, untuk memastikan kondisi yang tepat untuk berjalannya reaksi.
Polymerase-chain-reaction

Prinsip PCR (sumber: microbiologyinfo)

PCR melibatkan proses pemanasan dan pendinginan yang disebut siklus termal yang dilakukan oleh mesin. Ada tiga tahap utama yaitu:

  1. Denaturasi – ketika template DNA untai ganda dipanaskan untuk memisahkan menjadi dua untai tunggal.
  2. Annealing – ketika suhu diturunkan untuk mengaktifkan primer DNA untuk menempel ke DNA template.
  3. Extending/elongation – ketika suhu dinaikkan dan untai baru DNA dibuat oleh enzim polimerase Taq.

Ketiga tahap diulang 20-40 kali (cycles, siklus), dihasilkan jumlah salinan sebanyak dua kali lipat setiap kali siklus. Reaksi PCR lengkap dapat dilakukan dalam beberapa jam, atau bahkan kurang dari satu jam dengan mesin kecepatan tinggi tertentu. Setelah PCR telah selesai, metode yang disebut elektroforesis dapat digunakan untuk memeriksa kuantitas dan ukuran fragmen DNA yang dihasilkan.

Apa yang terjadi pada setiap tahap PCR?

Tahap denaturasi

  • Selama tahap ini, campuran yang mengandung DNA template dan semua bahan inti lainnya dipanaskan untuk 94-95⁰C.
  • Suhu tinggi menyebabkan ikatan hidrogen antara basa di dua untai DNA template akan putus dan terpisah menjadi dua helai.
  • Hal ini menyebabkan dua untai tunggal DNA, yang akan bertindak sebagai template untuk produksi untai baru DNA.
  • Penting bahwa suhu dipertahankan pada tahap ini cukup lama untuk memastikan bahwa untai DNA telah dipisahkan sepenuhnya.
  • Hal ini biasanya membutuhkan waktu antara 15-30 detik.

Tahap annealing

  • Selama tahap ini reaksi didinginkan sampai 50-65⁰C. Hal ini memungkinkan primer untuk menempel ke lokasi tertentu pada DNA template untai tunggal dengan cara ikatan hidrogen (suhu yang tepat tergantung pada suhu leleh primer (Tm, melting point) yang digunakan).
  • Primer adalah untaian tunggal DNA atau RNA dengan panjang sekitar 20 sampai 30 nukleotida.
  • Primer dirancang untuk menjadi pelengkap di urutan pendek DNA pada setiap akhir urutan yang akan disalin.
  • Primer berfungsi sebagai titik awal untuk sintesis DNA. Enzim polimerase hanya dapat menambahkan basa DNA untuk untai ganda DNA. Oleh karena itu, enzim bisa bekerja setelah primer menempel dan komplemen pada DNA template dan memulai membuat DNA baru.
  • Dua helai DNA yang terpisah adalah saling melengkapi dan berjalan dalam arah yang berlawanan (dari ujung 5′ dan ujung 3′); oleh karena itu, digunakan dua buah primer yaitu primer maju (forward) dan primer terbalik (reversed).
  • Langkah ini biasanya membutuhkan waktu sekitar 10-30 detik.

Tahap extending/elongation

  • Selama langkah terakhir ini, panas meningkat menjadi 72⁰C untuk mengaktifkan DNA baru yang akan dibuat oleh enzim DNA polimerase Taq yang menambahkan basa DNA.
  • Enzim Taq DNA polymerase adalah enzim yang diambil dari bakteri tahan panas-Thermus aquaticus. Bakteri ini biasanya hidup di sumber air panas sehingga dapat mentolerir suhu di atas 80⁰C. DNA polimerase pada bakteri ini sangat stabil pada suhu tinggi, yang berarti dapat menahan suhu yang diperlukan untuk memecahkan untaian DNA terpisah dalam tahap denaturasi dari PCR.
    DNA polimerase dari kebanyakan organisme lain tidak akan mampu menahan suhu tinggi, misalnya, polimerase manusia bekerja idealnya di 37 oC (suhu tubuh).
  • Suhu 72⁰C adalah suhu optimum untuk Taq polimerase untuk membangun untai komplementer. Enzim menempel ke primer dan kemudian menambahkan basa DNA ke untai tunggal satu-per-satu pada arah 5’ ke 3’.
  • Hasilnya adalah pita untai baru DNA dan molekul untai ganda DNA.
  • Durasi tahap ini tergantung pada panjang urutan DNA yang diperkuat tetapi biasanya memakan waktu sekitar satu menit untuk menyalin 1.000 basa DNA (1kb).

Ketiga proses siklus termal diulang 20-40 kali untuk menghasilkan banyak salinan dari urutan DNA yang diinginkan. Perlu diketahui bahwa fragmen baru DNA yang dihasilkan selama PCR juga berfungsi sebagai template bagi enzim DNA polimerase sehingga dapat menempelkan dan mulai membuat DNA. Hasilnya adalah sejumlah besar salinan segmen DNA spesifik yang dihasilkan dalam waktu yang relatif singkat.

Referensi

What is CR (polymerase chain reaction), yourgenome.org, diakses tanggal 11 April 2017

Advertisements

Author: admin

menebar ilmu pengetahuan

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s