Moko Apt

Menebar Ilmu Pengetahuan

Pemetaan Genom

1 Comment


Sekunsing DNA merupakan teknologi canggih, namun memiliki keterbatasan: tidak bisa mensekuen lebih dari 750 bp dalam satu eksperimen. Ini artinya ketika bekerja dengan DNA yang panjang perlu dilakukan:

  1. memecah molekul menjadi fragmen-fragmen
  2. menentukan urutan satu per-satu
  3. mencari tumpang tindihnya (overlap) dan membuat jadi rangkaian dinamakan master sekuens (tentunya menggunakan komputer).

Metode shotgun biasa dilakukan untuk genom prokariot kecil, namun untuk genom yang lebih besar akan sulit karena komputernya pusing (bayangkan jika ada n fragmen, overlap-nya 2 n(kuadrat) – 2n). Masalah kedua, kalo ada bagian berulang, maka hasil akan eror.

Oleh karena sulitnya menerapkan metode shotgun dengan keterbatasan di atas, maka genome map harus dibuat. Genome map menyediakan panduan untuk eksperimen sekuensing dengan menunjukkan posisi gen dan ciri khas lainnya. Ketika genome map tersedia, fase sekuensing dapat dilanjutkan dengan 2 cara:

  1. dengan metode whole-genome shotgun
  2. dengan metode clone contig.

Ada dua jenis khas dari “maps” yang digunakan dalam bidang pemetaan genom:

  1. genetic mapping, didasarkan pada penggunaan teknik genetik untuk mengkonstruksi peta yang menunjukkan posisi gen dan fitur sekuen lainnya pada genom. Teknik genetik termasuk eksperimen cross-breeding, dan dalam kasus manusia yaitu pemeriksaan sejarah keluarga (silsilah) (pedigree analysis).
  2. physical mapping, menggunakan teknik biologi molekuler untuk memeriksa molekul DNA secara langsung dalam rangka untuk mengkonstruksi peta yang menunjukkan posisi urutan fitur, termasuk gen.

I. Genetic mapping (pemetaan genetik atau linkage maps atau pemetaan pautan)

Pertama, tentukan dulu markernya. Apa? Gen. Pada prokariot gen ini sangat membantu, misal marker ADE2, fenotipnya memerlukan adenin. Metode pengecekannya, S. cerevisiae bisa tumbuh hanya jika medium mengandung adenin.

Selain gen, apa ada lagi? Mengingat pada manusia jarak antar gen dipisahkan oleh pemisah yang sangat panjang. Juga tidak semua gen berada dalam bentuk alel yang dapat dibedakan dengan mudah. Jadi, diperlukan tipe marker yang lain. Apakah itu? Kita namakan DNA marker. Sama seperti gen marker, pada DNA marker jug harus punya dua alel supaya bisa berguna. Ada 3 fitur urutan DNA yang memenuhi kriteria ini:

  1. RFLP (dibaca Rif-lips)
  2. SSLP
  3. SNP (dibaca Snip)

RFLP (restriction fragment length polymorphisms)

RFLP adalah tipe pertama dari DNA marker yang dipelajari. Kita ingat bahwa enzim restriksi memotong DNA pada sekeuns tertentu. Spesifisitas sekuens berarti perlakuan enzim restriksi pada molekul DNA semestinya selalu menghasilkan fragmen yang sama. Namun ini tidak menjadi selalu jika DNA genomik adalah polimorfisme pada situs restriksi, berada pada dua alel dengan alel pertama sekuesnya benar namun alel kedua terjadi perubahan. Akibatnya pada sekuens yang mengalami perubahan, tetap akan tersambung setelah pemberian enzim restriksi, menghasilkan apa yang dinamakan lenght polymorphism. Inilah prinsip RFLP, dan posisinya dalam peta genom dapat dikerjakan dengan mengikuti warisan alele. Ada sekitar 100.000 RFLP pada genom mamalia.

Screen Shot 2016-04-01 at 11.38.41

Dua metode untuk scoring RFLP:

  • RFLP dapat di-score dengan hibridisasi Sourthern. DNA didigesti dengan enzim restriksi yang cocok lalu dipisahkan pada gel agarose. Noda (smear) dari fragmen pada gel ditransfer ke membran nilon dan diselidiki menggunakan DNA probe dengan polimorfisme situs restriksi. Jika situs absen, maka hanya ada satu fragmen (lane 2); jika situs ada, maka akan ada dua fragmen (lane 3).
  • RFLP dapat di-type menggunakan PCR, dengan primer yang akan anneal pada sisi situs polimorfisme. Setelah PCR, produk dipotong dengan enzim restriksi yang sesuai lalu dianalisis menggunakan gel agarosa. Jika situs absen, maka alan ada satu pita (lane 2); jika situs ada maka akan ada 2 pita (lane 3).

Screen Shot 2016-04-01 at 11.38.51

SSLP (simple sequence length polymorphisms)

SSLP adalah susunan (array) sekuens berulang dengan panjang bervariasi, alel berbeda memiliki perbedaan jumlah unit pengulangan. Tidak seperti RFLP, SSLP bisa multi-alel karena tiap SSLP bisa memiliki sejumlah variasi panjang yang berbeda. Ada dua bentuk SSLP yaitu minisatelit (atau variable number of tandem repeats/VNTR) dan mikrosatelit (atau simple tandem repeats/STR).

Mikrosatelit/STR lebih populer sebagai DNA marker karena 2 alasan berikut:

  • mikrosatelit tidak terseber pada seluruh genom namum lebih sering ada di bagian telomer.
  • mikrosatelit panjangnya biasanya 10-30 kopi pengulangan atau kurang dari 6 bp, sehingga ketika analisis menggunakan PCR akan lebih cepat dan lebih akurat. Ada 500.000 mikrosatelit dengan unit pengulangan 6bp pada genom manusia.

Pemeriksaan menggunakan PCR lalu divisualisasikan pada gel agarosa. Metode lain yang lebih oke menggunakan capilary electrophoresis (dengan sistem detektor fuloresens).

Screen Shot 2016-04-01 at 11.42.12

SNP (single nucleotide polymorphisms)

Pada genom pada beberapa individu terdapat perbedaan satu nukleotida, misal pada individu satu yaitu G, pada individu lain C. Ada banyak sekali SNP pada setiap genom, misal pada manusia terdpat 4 juta. SNP berasal dari mutasis titik.

Metode untuk typing yaitu oligonucelotide hybridization analysis. Berikutnya dikembangkan teknologi skrining berdasar prinsip metode tsb yaitu: (1) teknologi DNA chip, (2) solution hybridization technique. Metode typing lainnya: oligonucleotide ligation assay (OLA) dan ARMS (amplification refractory mutation system).

Kita telah merangkai set marker untuk konstruk genetic map, selanjutnya kita akan membahas bagaimana tekniknya. Teknik yang digunakan adalah berdasar genetic linkage (bahasan ini susah, tidak saya bahas).

The principle of genetic linkage is the observation that some genes will be inherited together if they are located on the same chromosome.

II. Physical Mapping

Genetic maps have relatively poor resolution and tend to be inaccurate, and must be refined by physical mapping if the map is to be used in a genome sequencing project.

A physical map is generated by methods that directly locate the positions of specific sequence on a chromosomal DNA molecule.

The most important techniques:

  • restriction mapping
  • fluorescent in situ hybridization (FISH)
  • sequence tagged site (STS) mapping

The positions of restriction sites in a small DNA molecule can be determined by restriction mapping, but this is only of limited value with eukaryotic chromosomes.

Of greater utility is fluorescent in situ hybridization (FISH), in which a preparation of intact chromosomes, possibly ones that have been elongated by mechanical stretching, is probed with a fluorescently labeled marker. The position at which hybridization occurs is determined by examining the preparation by confocal microscopy.

The most detailed physical maps are obtained by sequence tagged site (STS) content mapping, which makes use of a mapping reagent, a collection of overlapping DNA fragments that span an entire chromosome or genome. The map position of a marker is determined by identifying which fragments in the collection contain copies of the marker. The mapping reagent can be a library of clones or a radiation hybrid panel.

The data resulting from STS analysis, from which the physical map is generated, can equally well be used to determine which clones contain overlapping DNA fragments, enabling a clone contig to be built up. This assembly of overlapping clones can be used as the base material for a lengthy, continuous DNA sequence, and the STS data can later be used to anchor this sequence precisely onto the physical map. If the STSs also include SSLPs that have been mapped by genetic linkage analysis then the DNA sequence, physical map, and genetic map can all be integrated.

Bacaan lebih lanjut

Genome, Brown

Wikipedia (info masih sangat minim di halaman ini), untuk yang bahasa inggris lumayan.

FISH technique (Wikipedia)

FISH nature

Author: admin

menebar ilmu pengetahuan

One thought on “Pemetaan Genom

  1. bermanfaat mimin. salam kenal !

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s