Moko Apt

Menebar Ilmu Pengetahuan

Tinjauan tentang ELISA

16 Comments


Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) adalah suatu teknik biokimia yang terutama digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau antigen dalam suatu sampel. ELISA telah digunakan sebagai alat diagnostik dalam bidang medis, patologi tumbuhan, dan juga berbagai bidang industri.

Penggunaan ELISA melibatkan setidaknya satu antibodi dengan spesifitas untuk antigen tertentu. Sampel dengan jumlah antigen yang tidak diketahui diimobilisasi pada suatu permukaan solid (biasanya berupa lempeng mikrotiter polistirene), baik yang non-spesifik (melalui penyerapan pada permukaan) atau spesifik (melalui penangkapan oleh antibodi lain yang  spesifik untuk antigen yang sama, disebut ‘sandwich’ ELISA).

Setelah antigen diimobilisasi, antibodi pendeteksi ditambahkan, membentuk kompleks dengan antigen. Antibodi pendeteksi dapat berikatan juga dengan enzim, atau dapat dideteksi  secara langsung oleh antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim melalui biokonjugasi. Di antara tiap tahap, plate harus dicuci dengan larutan deterjen lembut untuk membuang kelebihan protein atau antibodi yang tidak terikat. Setelah tahap pencucian terakhir, dalam plate ditambahkan substrat enzimatik untuk memproduksi sinyal yang visibel, yang menunjukkan  kuantitas antigen dalam sampel. Teknik ELISA yang lama menggunakan substrat kromogenik, meskipun metode-metode terbaru mengembangkan substrat fluorogenik yang jauh lebih sensitif.

Aplikasi ELISA

ELISA dapat mengevaluasi kehadiran antigen dan antibodi dalam suatu sampel, karenanya merupakan metode yang sangat berguna untuk menentukan konsentrasi  antibodi  dalam serum (seperti dalam tes HIV), dan juga untuk mendeteksi adanya antigen. Metode ini juga bisa diaplikasikan dalam indiustri makanan untuk mendeteksi allergen potensial dalam makanan seperti susu, kacang, walnut, almond, dan telur. ELISA  juga dapat digunakan dalam bidang toksikologi untuk uji pendugaan cepat pada berbagai kelas obat.

Beberapa Tipe ELISA

A. Indirect ELISA

Tahap umum yang digunakan dalam indirect ELISA untuk menentukan konsentrasi antibodi dalam serum adalah:

1. Suatu antigen yang sudah dikenal dan diketahui konsentrasinya ditempelkan pada permukaan lubang plate mikrotiter. Antigen tersebut akan menempel pada permukaan plastik dengan cara adsorpsi. Sampel dari konsentrasi antigen yang diketahui ini akan menetapkan kurva standar  yang digunakan untuk mengkalkulasi konsentrasi antigen dari suatu sampel yang akan diuji.

2. Suatu larutan pekat dari protein non-interacting, seperti bovine serum albumin (BSA) atau kasein, ditambahkan dalam semua lubang plate mikrotiter.  Tahap ini dikenal sebagai blocking, karena protein serum memblok adsorpsi non-spesifik dari protein lain ke plate.

3. Lubang plate mikrotiter atau permukaan lain kemudian dilapisi dengan sampel serum dari antigen yang tidak diketahui, dilarutkan dalam buffer yang sama dengan yang digunakan untuk antigen standar. Karena imobilisasi antigen dalam tahap ini terjadi karena adsorpsi non-spesifik, maka konsentrasi protein total harus sama dengan antigen standar.

4. Plate dicuci, dan antibodi pendeteksi yang spesifik untuk antigen yang diuji dimasukkan dalam lubang. Antibodi ini hanya akan mengikat antigen terimobilisasi pada permukaan lubang, bukan pada protein serum yang lain atau protein yang terbloking.

5. Antibodi sekunder, yang akan mengikat sembarang antibodi pendeteksi, ditambahkan dalam lubang. Antibodi sekunder ini akan berkonjugasi menjadi enzim dengan substrat spesifik. Tahap ini bisa dilewati jika antibodi pendeteksi berkonjugasi dengan enzim.

6. Plate dicuci untuk membuang kelebihan konjugat enzim-antibodi yang tidak terikat.

7. Dimasukkan substrat yang akan diubah oleh enzim untuk mendapatkan sinyal kromogenik/ fluorogenik/ elektrokimia.

8. Hasil dikuantifikasi dengan spektrofotometer, spektrofluorometer atau alat optik/ elektrokimia lainnya.

Enzim bertindak sebagai amplifier, bahkan jika hanya sedikit antibodi terikat enzim yang tetap terikat, molekul enzim akan memproduksi berbagai molekul sinyal. Kerugian utama dari metode indirect ELISA adalah metode imobilisasi antigennya non-spesifik, sehingga setiap protein pada sampel akan menempel pada lubang plate mikrotiter, sehingga konsentrasi analit yang kecil dalam sampel harus berkompetisi dengan protein serum lain saat pengikatan pada permukaan lubang. Mekanisme indirect ELISA dapat dilihat pada gambar di bawah ini.

2. Sandwich ELISA (untuk ujian besok pelajari yang ini saja)

Tahapan dalam Sandwich ELISA adalah sebagai berikut:

  1. Disiapkan permukaan untuk mengikatkan antibodi ‘penangkap’
  2. Semua non spesifik binding sites pada permukaan diblokir
  3. Sampel berisi antigen dimasukkan dalam plate
  4. Plate dicuci untuk membuang kelebihan antigen yang tidak terikat
  5. Antibodi primer ditambahkan, supaya berikatan secara spesifik dengan  antigen
  6. Antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim dimasukkan, yang akan berikatan dengan antibodi primer
  7. Plate dicuci, sehingga konjugat antibodi-enzim yang tidak terikat dapat dibuang
  8. Ditambahkan reagen yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal berwarna/ berfluoresensi/ elektrokimia
  9. Diukur absorbansinya  untuk menetukan kehadiran dan kuantitas dari antigen

Keuntungan utama dari metode sandwich ELISA adalah kemampuannya menguji sampel yang tidak murni, dan mampu mengikat secara selektif antigen yang dikehendaki. Tanpa lapisan pertama antibodi penangkap, semua jenis protein pada sampel (termasuk protein serum) dapat diserap secara kompetitif oleh permukaan lempeng, menurunkan kuantitas antigen yang terimobilisasi. Prinsip kerja sandwich ELISA dapat dilihat pada skema berikut ini:

3. ELISA kompetitif

Tahapan pengerjaan ELISA kompetitif berbeda dari dua metode yang telah dibahas sebelumnya, yaitu:

  1. Antibodi yang tidak berlabel diinkubasi dengan kehadiran antigennya
  2. Komplek antigen-antibodi ini selanjutnya ditambahkan pada lubang yang telah dilapisi antigen
  3. Plate dicuci, sehingga kelebihan antibodi tercuci (semakin banyak antigen dalam sampel, semakin sedikit antibodi yang dapat terikat pada antigen yang menempel pada permukaan lubang, karena inilah disebut kompetisi
  4. Ditambahkan antibodi sekunder yang spesifik utnuk antibodi primer. Antibodi sekunder ini berpasangan dengan enzim
  5. Substrat ditambahkan, enzim akan mengubah substrat menjadi sinyal kromogenik/ fluoresensi.

Dalam ELISA kompetitif, semakin tinggi konsentrasi antigen orisinal, semakin lemah sinyal yang dihasilkan. Prinsip kerjanya dapat dilihat pada gambar berikut ini:

Secara singkat tahapan kerja dalam metode ELISA dapat digambarkan sebagai berikut:

Sekian dulu artikel tentang ELISA, sampai jumpa.

Author: admin

menebar ilmu pengetahuan

16 thoughts on “Tinjauan tentang ELISA

  1. Pak saya smster 4 jurusan farmasi mau tanya, knapa ya pak hrs dilakukan pem blokan terhadap non spesifik binding? Saya kurang mengerti pak, mohon penjelasannya jika berkenan 😁

  2. waah makasih banget lho, ini sangat membantu tugas akhir saya di IPB jurusan analisis kimia🙂

  3. salam kenal pak, sblmny saya smstr 3 jursn farmasi. ada yg mau saya tanyakan..
    ada sebuah jurnal yg mngatakan kalau sELISA menggunakan antibodi monoklonal-MAb 2F3 juga memakai PAb
    yg jd pertanyaan, antibodi monoklonal ini akan mempengaruhi apanya dan apa bedanya hasil yg akan d berikan MAb dan PAb
    ini jurnal mengenai penggunaan sELISA utk mendeteksi EHEC/EPEC O26

  4. sangat membantu bapak😀

  5. Wah makasih nih informasinya.. mantab.. kebetulan sehari2 sy operasiin ELISA..
    jd lbih fresh lagi ..

  6. terimakasih banyak infonya🙂

  7. waahh…. makasihh gan..
    nambah ilmu lagi nih ^^

  8. makasih ya dah bagi2 ilmu…

  9. sangat membantu gan ….😀

  10. sangat membantu gannnn ..😀

  11. pak, soal bioteknya jangan susah2 yaa

  12. waaahh.. jadi inget kuliahnya pak hendri duluuu🙂

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s