Moko Apt

Menebar Ilmu Pengetahuan

Novel Prodrug dari TEGAFUR

2 Comments


Oleh: Sarmoko, MN Abdi Sahid, Eka Siswanto, Oktaviana, Wa Ode Siti Musnina

Pendahuluan

Kanker adalah suatu penyakit sel dengan ciri gangguan atau kegagalan mekanisme pengatur multiplikasi dan fungsi homeostasis lainnya pada organisme multiseluler. Sel kanker berasal dari sel normal yang mengalami perubahan sifat sehingga dapat tumbuh dan berkembang tanpa terkendali, serta dapat menyusup dan merusak jaringan di sekitarnya, bahkan menyebar ke jaringan tubuh lain. Oleh karena kompleksitas penyakit kanker menjadi sulit untuk diobati dan insidensinya cenderung meningkat dari tahun ke tahun (Hanahan and Weinberg, 2000).

Obat antikanker adalah senyawa kemoterapi yang digunakan untuk pengobatan tumor yang membahayakan kehidupan sel kanker. Obat antikanker sering dinamakan pula sebagai obat sitotoksik, sitostatik, atau senyawa antineoplastik (Siswandono and Soekardjo, 1995). Agen antikanker mempunyai target aksi yang berbeda terhadap sel kanker (Gambar 1).

gambar 1

Gambar 1. Ringkasan mekanisme dan target aksi obat antikanker (Gringauz, 1997)

Agen kemoterapi konvensional yang sering digunakan di antaranya adalah ageng pengalkil (Klorambusil, tiotepa, mekloretamin, dan siklofosfamid), antimetabolit (6-merkaptopurin, 5-FU, metrotreksat), antibiotik (aktinomisin, bleomisin, doksorubisin), mitotic inhibitor (vinblastin, vinkristin, kolkisin, indibulin, taksol), dan hormon (dietilstibestrol, tamoxifen). Ternyata banyak masalah yang ditimbulkan dari penggunaan obat-obat tersebut, seperti kasus resistensi sel kanker atau multidrug resistance dan ketidakselektifan agen tersebut yang juga membunuh sel normal. Oleh karena itu, dikembangkan obat dengan target spesifik dengan mekanisme molekuler tertentu sehingga memperbaiki efektivitas obat antikanker.

Golongan antimetabolit pirimidin yang telah lama digunakakan adalah 5-FU. Obat ini sering diberikan dalam bentuk prodrug yang memerlukan aktivasi untuk menghambat sintesis DNA. 5-FU sering dikombinasikan dengan agen lain untuk memperbaiki aktivitasnya seperti UFT (5-FU-Tegafur) atau leucovorin (S-1). Tegafur merupakan prodrug dari 5-FU yang digunakan secara oral yang beraksi sebagai inhibitor kompetitif DPD (Dihydro Pyrimidine Dehydrogenase) dan akhirnya membunuh sel kanker.

Untuk lebih meningkatkan aktivitas antikanker dari tegafur, disintesis suatu prodrugs dengan novel multifungsi antimetabolit (Tabel 1). Senyawa 3 adalah 5-fluoro-1-(tetrahydrofuran-2-yl)-3-(hydroxymethyl)pyrimidine-2,4(1H,3H)-dione butyrate, senyawa 2 yaitu 5-fluoro-1-(tetrahydrofuran-2-yl)-3-(hydroxymethyl)pyrimidine-2,4(1H,3H)-dione, dan senyawa 5 yaitu diethyl (5-fluoro-2,3-dihydro-3-(tertahydrofuran-2-yl)-2,6-dioxopyrimidin-1(6H)-yl)methyl phosphate.

Tabel 1. Turunan tegafur dan metabolit yang dihasilkan

gambar 2

Modifikasi pada stuktur tegafur dimungkinkan karena adanya gugus fungsional imido pada struktur tegafur yang dapat bereaksi dengan formaldehid membentuk turunan N-hidroksimetil dan berekasi dengan klorometil atau 1-klorometil butirat memberikan turunan N-butiroiloksialkil yang stabil.

gambar 2

Gambar 2. Sintesis prodrug tegafur

Structure–Activity Relationships (SAR)

Prodrug yang kami pelajari sebenarnya kami sebut sebagai “drug combination treatment” karena setelah mengalami proses metabolisme dapat dihasilakan 2-3 senyawa antikanker aktif seperti tegafur, formaldehid, dan asam butirat. Studi SAR dilakukan dengan mempelajari kontribusi tiap metabolit terhadap keseluruhan aktivitas biologis.

Senyawa 3 dan 2 sama-sama menghasilkan tegafur dan formaldehid, berbeda hanya pada tambahan metabolit asam butirat pada senyawa 3 dan ini digunakan untuk mempelajari pengaruh metabolit asam butirat terhadap keseluruhan aktivitas biologis. Sedangkan senyawa 5 merupakan modifikasi dari senyawa 2 dengan penambahan gugus dietilfosfat untuk mempelajari pengaruhnya dikaitkan dengan kelarutannya dalam air. Untuk mempelajari kontribusi formaldehid, maka senyawa 3 dan 4 dibedakan yaitu pada senyawa 4 menghasilkan metabolit asetaldehid.

Efek Tegafur (1) dan turunannya terhadap viabilitas sel kanker

Tegafur dan keempat senyawa turunannya dibandingkan aktivitas antikankernya, terutama kemampuannya dalam membunuh sel kanker dan selektivitasnya terhadap sel kanker.

Kemampuan tegafur dan turunannya dalam membunuh sel dilakukan dengan mengukur viabilitas sel menggunakan Hoechst assay. Untuk membandingkan potensi masing-masing senyawa ditentukan dengan nilai IC50 dan IC90. Untuk semua jenis sel kanker yang digunakan, nilai IC50 Tegafur secara signifikan lebih tinggi (3-7 kali lipat) dibandingkan dengan senyawa turunannya. Ini berarti potensi tegafur lebih rendah karena diperlukan konsentrasi yang tinggi untuk bisa membunuh sel kanker.

Pada seluruh jenis sel kanker yang diujikan, nilai IC50 senyawa 3 secara signifikan lebih rendah dibandingkan dengan senyawa 2. Senyawa 3 akan menghasilkan senyawa aktif formaldehid, asam butirat dan tegafur, sedangkan senyawa 2 akan menghasilkan senyawa aktif formaldehid dan tegafur. Hasil ini menunjukkan bahwa adanya metabolit berupa asam butirat pada senyawa 3 berkontribusi dalam penguatan ektivitas antikanker.

Asam butirat dan formaldehid pada beberapa penelitian dapat mempotensiasi aktivitas antikanker dan bekerja secara sinergis dengan beberapa agen kemoterapi dengan mekanisme kerjasama yang belum diketahui. Asam butirat kemungkinan meningkatkan aktivitas antikanker dengan kemampuannya dalam menghambat HDAC (histon deasetilase).

Peran formaldehid dalam meningkatkan aktivitas antikanker belum sepenuhnya dipahami. Untuk meyakinkan adanya pengaruh formaldehid terhadap aktivitas antikanker, senyawa 3 yang melepaskan senyawa aktif formaldehid dibandingkan dengan senyawa 4 yang melepaskan senyawa aktif asetaldehid. Nilai IC50 senyawa 4 secara signifikan lebih tinggi 2,5-4 kali lipat dibandingkan dengan senyawa 3. Ini menunjukan adanya kontribusi yang signifikan dari formaldehid terhadap peningkatan aktivitas antikanker.

Dua eksperimen lanjutan menguatkan temuan tersebut. Eksperimen pertama menggunakan bahan pengikat formaldehid yang menyebabkan formaldehid kehilangan aktivitasnya. Penelitian ini masih menggunakan senyawa 2 dan 3. Nilai IC50 senyawa 3 setelah penambahan bahan pengikat formaldehid (dalam eksperimen ini digunakan semikarbazid) meningkat 1,3-1,5 kali, sedangkan nilai IC50 senyawa 2 meningkat 2-2,5 kali. Aktivitas senyawa 2 terlihat lebih dipengaruhi oleh bahan pengikat formaldehid. Hal ini dapat dipahami karena senyawa 2 hanya melepaskan senyawa aktif formaldehid (disamping tegafur).

Eksperimen kedua menggunakan tegafur dan penambahan agonis formaldehid HMTA dan suksinat. HMTA akan terhidrolisis di dalam sel menghasilkan formaldehid, sedangkan suksinat akan menghambat metabolisme formaldehid dalam sel yang menyebabkan peningkatan jumlah formaldehid. Nilai IC50 tegafur dengan keberadaan agonis formaldehid lebih rendah 2-3 kali dibandingkan nilai IC50 tegafur sebagai senyawa tunggal.

Kemampuan formaldehid dalam menghancurkan membran mitokondria melalui mekanisme tergantung reactive oxigen species (ROS)

Formaldehid telah menunjukan perannya dalam peningkatan aktivitas antikanker. Penelitian ini menghipotesiskan aktivitas peningkatan aktivitas antikanker yang diperlihatkan oleh formaldehid diperoleh dari kemampuannya menghancurkan membran mitokondria melalui mekanisme tergantung reactive oxigen species (ROS). Hipotesis ini didukung oleh penelitian yang membandingkan aktivitas antikanker senyawa 3 dengan tegafur. Keberadaan NAC (N-acetylcystein) yang merupakan suatu antioksidan dalam sel mengurangi sitotoksisitas dan kematian sel, serta menggagalkan pengrusakan potensial membran mitokondria yang disebabkan senyawa 3. Dan hal ini tidak terjadi pada sel yang diberikan tegafur, di mana kematian sel tidak berubah signifikan dengan penambahan NAC.

Selektivitas tegafur dan senyawa turunannya dibandingkan dengan membandingkan nilai IC50 masing-masing senyawa tersebut pada sel astrosit normal dan sel glioblastoma. Nilai IC50 tegafur pada sel astrosit normal 4,3 dan 7,7 mM, sedangkan pada sel glioblastoma 0,38 dan 1,3 mM. Ini menunjukan bahwa aktivitas tegafur pada sel glioblastoma lebih tinggi 6-11 kali dibandingkan pada sel normal. Perbandingan nilai IC50 dan IC90 pada senyawa 3 memperlihatkan nilai yang lebih tinggi 3-4 kali, senyawa 2 lebih tinggi 2 kali dan senyawa 5 lebih tinggi 10-11 kali. Ini memperlihatkan bahwa diantara turunan tegafur, senyawa 5 memperlihatkan selektivitas yang paling besar.

Senyawa 5 merupakan modifikasi dari senyawa 2. Penambahan gugus dietilfosfat pada senyawa 2 membentuk senyawa 5 meningkatkan aktivitas antikankernya secara signifikan. Hal ini dihubungkan dengan gugus dietilfosfat yang meningkatkan kelarutan dalam air. Selain meningkatkan kelarutan dalam air, gugus dietil fosfat pada penelitian lain juga menunjukan peningkatan aktivitas antikanker dengan mekanisme yang belum diketahui.

Uji Antiangiogenesis

Uji berikutnya untuk membandingkan aktivitas antikanker Tegafur dan senyawa 3 adalah melalui mekanisme antiangiogenesis secara in vitro. Sel kanker mampu memacu angiogenesis. Angiogenesis merupakan pertumbuhan pembuluh darah baru di sekitar jaringan kanker untuk memenuhi kebutuhan sel akan nutrisi dan oksigen. Apabila kebutuhan sel telah terpenuhi dengan baik, dengan mudah sel kanker dapat menginvasi jaringan lainnya (Pecorino, 2005).

Pada penelitian ini di gunakan sel HUVEC, Human Umbilical Vein Endothelial Cells, dengan metode tube formation assay. Tube Formation Assay berdasarkan kemampuan sel endothelial untuk membentuk bentuk 3D kapiler-seperti struktur tubular/pipa ketika di kulturkan pada gel basement membrane extract (BME).

gambar 3

Gambar 3. Pembentukan formasi tube oleh pemberian tegafur dan senyawa 3

Kemampuan tegafur dan senyawa 3 dalam menghambat pembentukan tube diperiksa dengan sel HUVEC yang sebelumnya dilapisi dengan matrigel yang diperkaya dengan faktor pertumbuhan endotel (EGF, endiothelial growth factor). Pada kondisi untreated, sel akan membentuk jejaring serupa dengan bentuk tube 3D dan semakin lama waktu inkubasi tube akan terlihat lebih nyata. Hasil pengamatan menunjukkan pada jam 3 dan 8, terlihat formasi tube hanya pada kelompok kontrol dan perlakuan tegafur, sedangkan pada perlakuan senyawa 3, terdeteksi hanya terdapat sel-sel tunggal dan beberapa tube kecil. Setelah 24 jam, hanya beberapa tabung pada perlakuan tegafur dan tidak ada tube yang terlihat pada perlakuan senyawa 3. Hasil ini menunjukkan bahwa telah terjadi proses penghambata pembentukan tube pada matriks gel oleh pemberian tegafur atau senyawa 3, dan hasil penghambatan yang sigifikan oleh senyawa 3.

Senyawa 3 Memiliki aktivitas menghambat histone deacetylase (HDAC)

Sebagaimana telah disebutkan di atas bahwa asam butirat diharapkan beraksi sebagai HDAC inhibitor. Senyawa 3 setelah dimetabolisme secara hidrolisis melepaskan HDAC inhibitor yaitu asam butirat bersama dengan tegafur dan formaldehida. HDAC inhibitor adalah agen kemoterapetik yang menjanjikan untuk pengobatan kanker. Asam butirat merupakan agen antikanker yang memiliki efek spesifik pada pengabatan enzim HDAC, dan memicu kenaikan level asetilasi histon H3 dan H4.

Untuk menguji aktivitas ini dilakukan inhibisi secara in vivo menggunakan tikus Balb/c yang di tanam secara sc implan tumor 4T1. Setelah tikus mengalamai tumor, dilakukan pemberian tegafur po atau senyawa 3. Untuk mengetahui level asetilasi histon tumor, setelah 4 jam perlakuan ekstrak tumor pada hewan yang telah dikorbankan dievaluasi menggunakan analisis Western blot. Hasil yang didapat adalah terjadi kenaikan lebih dari 2 kali lipat asetilasi.

Gambar 4. Level asetilasi histon H4 pengaruh pemberian tegafur dan senyawa 3

Pengamatan ini menunjukkan bahwa senyawa 3 telah mencapai di lokasi tumor setelah 4 jam, dan asam butirat yang dilepaskan menghambat aktivitas HDAC di tumor, dibuktikan oleh peningkatan yang signifikan dalam asetilasi histon H4.

Penjelasan dari mekanisme ini adalah sebagai berikut:

Pada regulasi siklus sel, banyak protein yang berperan diantaranya adalah protein Rb. Protein Rb dapat mengikat dan menarik HDAC. Hal ini berakibat menambah sifat penghambatan pRb pada proses transkripsi gen.

Sebagaimana yang telah kita ketahui bahwa DNA dalam kromoson “dililitkan” pada protein-protein histon oktamer. Dalam hal ini terjadi pengikatan elektrostatik yang kuat karena DNA lebih bermuatan negatif, sedang histon bermuatan positif. Untuk dapat terjadi transkripsi gen, maka ikatan tersebut harus dilepas. Pelepasan ini dapat terjadi dengan adanya reaksi asetilasi histon oleh Histon acetyltransferase, dilakukan oleh protein p90RSK setelah diaktiviasi oleh ERK (salah satu downstream efektor pada signal transduksi melalui MAP kinase). Adanya pRb yang menarik HDACs dan masih mengikat E2F yang menempel pada DNA akan menyebabkan penghilangan gugus asetil dari histon sehingga mengembalikan ikatan elektrostatik histon-DNA dan menghalangi transkripsi gen. Hal ini terjadi karena akses E2F pada E2F responsive genes terhalangi.

Dengan penghambatan HDAC maka terjadi kenaikan level histon terasetilasi dan terjadi suppress pada proliferasi sel.

Gambar 5. Regulasi Histon deasetilasi pada transkripsi gene (DePinho, 1998)

Senyawa 3 dalam kemampuannya sebagai antimetastasis

Sel kanker memiliki kemampuan untuk menginvasi dan menyebar ke seluruh jaringan tubuh.  Kemampuan sel kanker untuk menginvasi dan menyebar ke jaringan lain yang terjadi melalui pembuluh darah dan pembuluh limfa ini disebut dengan tahap metastasis (Pecorino, 2005).

Pada penelitian ini digunakan Model Karsinoma metastatik 4T1 yaitu model murine syngeneic dari 4T1 karsinoma payudara (a syngeneic murine model of 4T1 breast carcinoma). Model ini dianggap sebagai model yang sangat menyerupai stadium IV dari kanker payudara.

Kelompok perlakuan yang menerima po dengan saline selama 1 minggu atau 50 mg /kg tegafur atau dosis equimolar 3 (75 mg / kg) selama 3 minggu. Hewan-hewan itu kemudian dikorbankan dan paru-paru tikus diperiksa untuk mengamati munculnya lesi metastasis.  Jumlah rata-rata metastasis pada kelompok perlakuan senyawa 3 secara signifikan lebih rendah dari kelompok perlakuan tegafur dan secara signifikan lebih rendah dari kelompok kontrol.

Gambar 6. Tingkat penurunan lesi pada senyawa 3 lebih rendah dibanding tegafur atau kontrol

Kelebihan dari senyawa 3 dibandingkan dengan tegafur sebagai agen antikanker selain in vitro juga diamati secara in vivo, menunjukkan bahwa sebagai agen antimetastatik senyawa 3 secara signifikan lebih baik daripada tegafur.
Pengaruh tegafur dan senyawa 3 pada pertumbuhan tumor dan survival dipelajari dengan Model Colon Carcinoma xenograft. Xenograft atau heterograft merupakan suatu transplant dari satu individu ke individu yang lain dari spesies yang berbeda (Stenesh, 1989), dalam hal ini digunakan tikus jantan CD1 berumur 2 bulan yang ditanam dengan sel kanker colon manusia HT-29 sebanyak 2,5 × 106.

Ketika tumor telah terbemtuk, binatang uji diperlakukan secara po dengan 50 mg / kg tegafur dan dibandingkan dengan dosis equimolar senyawa 3. Mencit kontrol hanya diperlakukan dengan vehicle. Kedua senyawa secara signifikan menghambat pertumbuhan tumor (p <<0,001) namun, pada senyawa 3 secara signifikan lebih baik daripada tegafur (p <0,05).

Pada model-29 HT, tingkat serum antigen karsinoma embrionik/carcinoma embryonic antigen (CEA) jugadiperiksa yang merupakan parameter pada progresi tumor. Perbandingan antara kelompok perlakuan menunjukkan bahwa baik tegafur maupun senyawa 3 sangat berkurang tingkat CEA (p <0,05), namun tingkat CEA rata-rata kelompok 3 secara signifikan lebih rendah dari kelompok tegafur.

Lalu, bagaimanakah toksisitas dari senyawa uji? Studi dose toxic dilakukan menggunakan tikus ICR. Dosis 100, 150, 200, 250, 500, dan 750 mg / kg senyawa 3 dan tegafur diberikan po untuk tikus. Satu tikus masing-masing kelompok meninggal setelah menerima dosis 500 mg / kg (tidak ada temuan kerusakan patologis). Empat hari setelah menerima 750 mg / kg po, pada kelompok tegafur, ada tambahan hewan yang mati (total 2). Dua minggu kemudian, dua tikus tambahan mati pada kelompok 4 / 11 (36%) dan tegafur, di, kelompok senyawa 3 hewan yang mati sebanyak 3 / 12 (25%). Dengan demikian, toksisitas yang diamati dapat dikaitkan dengan tegafur dan bukan pada formaldehida atau asam butirat yang dilepaskan. Selain itu, indeks terapeutik senyawa 3 memungkinkan margin keselamatan yang tinggi.
Kesimpulan

Dapat disimpulkan bahwa keuntungan dari prodrug senyawa 3 dengan banyak multifungsi sebagai agen antineoplastik berdasarkan kemampuannya pada berbagai target fungsi pada sel kanker yaitu:

  1. aktivitas ROS-sensitif dipengaruhi oleh formaldehid,
  2. penghambat fungsi HDAC dipengaruhi oleh asam butirat dan
  3. aktivitas sitotoksik ditimbulkan oleh tegafur tersebut.

Keuntungan tambahan sebagai konsekuensi utama dalam terapi kanker adalah kemampuannya untuk mengatasi multidrug resistance sel kanker.

Referensi

DePinho, RA.,1998, Transcriptional repression: The cancer-chromatin connection, Nature 391, 533-534

Gringauz, A., 1997, Introduction to Medicinal Chemistry, How Drugs Act and Why, Wile VCH, New York, 93-138.

Hanahan, D., and Weinberg, R.A. 2000. The Hallmarks of Cancer. Cell, 100:57-70.

Pecorino, L., 2005, Molecular Biology of Cancer Mechanism, Target, and Therapeutics, Oxford University Pers.

Siswandono and Soekardjo, 2000, Kimia Medisinal, Edisi kedua, Airlangga University Press, Surabaya.

Stenesh, J., 1989, Dictionary of Biochemistry and Molecular biology, Second Edition, A Wiley-Interscience Publication, New York, p. 216

Author: admin

menebar ilmu pengetahuan

2 thoughts on “Novel Prodrug dari TEGAFUR

  1. uji-ujinya dilakukan tahun berapa pak?

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s