Moko Apt

Menebar Ilmu Pengetahuan

Terapi Untuk Defisiensi Insulin

1 Comment


INSULIN

Insulin adalah suatu hormon polipetida yang diproduksi dalam sel-sel β kelenjar Langerhaens pankreas. Insulin berperan penting dalam regulasi kadar gula darah (kadar gula darah dijaga 3,5-8,0 mmol/liter). Kekurangan insulin dapat menyebabkan penyakit seperti diabetes mellitus tergantung insulin (diabetes tipe 1).

Bentuk terapi untuk kekurangan insulin dapat berupa:

  1. Providing insulin: insulin diberikan langsung pada pasien melalui suntikan
  2. Transplantasi: pankreas penderita yang sudah rusak diganti dengan yang baru melalui transplantasi.
  3. Gene therapy

INSULIN PROPERTIES

Fungsi insulin:

  1. Dapat menstimulasi trasport glukosa (juga asam amino, ion K, dan nutrient lain) ke dalam sel
  2. Dapat menstimulasi jalur biosintesis intraseluler (anabolic pathway) seperti sintesis glikogen
  3. Menghambat jalur katabolisme (pemecahan molekul besar menjadi molekul yang lebih kecil) seperti proses glikogenolisis yaitu pemecahan glikogen menjadi glukosa yang berakibat kadar glukosa darah naik
  4. Menstimulasi sintesis DNA dan protein

 

Insulin akan memacu berbagai macam ekspresi gen melalui pengaktifan berbagai macam gen, sintesis DNA dan produksi protein.

Secara umum insulin dapat mengontrol jalur metabolisme mealui:

  1. Menginduksi deposporilasi beberapa enzim regulator yang berperan dalam jalur anabolisme maupun katablisme
  2. Menginduksi regulasi level transkripsi dari beberapa gen yang mengkode enzim metabolik

Insulin terdiri dari 51 asam amino. Molekul insulin disusun oleh 2 rantai polipeptida A dan B yang dihubungkan dengan ikatan disulfida. Rantai A terdiri dari 21 asam amino dan rantai B terdiri dari 30 asam amino (Gambar 1, 2).

Gambar 1. Urutan asam amino pada manusia dan konformasi rantai A dan rantai B.

Gambar 2. Urutan asam amino pada manusia dan konformasi rantai A dan rantai B. Variasi pada tipe residu asam amino dan potensinya dalam keterlibatan primer dan atau heksamer telah diidentifikasi. (Modifikasi dari Brange dan Langkjaer, 1993)

Ada site-site pada insulin yang rentan terhadap degradasi oleh suatu enzim seperti carboxypeptidase A, leucin aminopeptidase, trypsin, dan Glu C. Glu C adalah suatu enzim mikrobial yang diproduksi oleh bakteri Staphylococcus. Glu C memotong insulin pada 4 tempat. Site tempat pengenalan enzim tripsin yaitu pada asam amino glisin dan arginin (Gambar 3).

Gambar 3. Tempat-tempat pemotongan insulin oleh enzim

Proinsulin mengalami proteolisis menjadi insulin dan residu 34 asam amino C peptida. Mature insulin terdiri dari 2 rantai polipeptida yang dihubungkan 2 ikatan disulfida dalam rantai. Proinsulin sendiri sebenarnya sudah mempunyai aktivitas sebagai insulin tanpa harus berubah menjadi insulin (aktivtasnya 10% dari aktivitas insulin). Oleh sebab itu, jika diharapkan long acting maka diberikan dalam bentuk proinsulin karena proinsulin sudah beraktivitas sementara proteolisis proinsulin menjadi insulin tetap berjalan sehingga waktu aksi akan lebih panjang (Gambar 4).

Gambar 4. Proteolytic processing of proinsulin yielding mature insulin

Insulin bervariasi dari satu organisme ke organisme lainnya, namun hal ini tidak membedakan aktivitasnya. Misal, insulin pada manusia, babi, dan sapi mempunyai perbedaan dalam susunan asam aminonya, tapi aktivitasnya tetap sama (Tabel 1).

Tabel 1

Perbedaan susunan asam amino pada insulin manusia, babi (pork), dan sapi (beef)

Spesies A8 A10 B28 B29 B30
Manusia Thr Ile Pro Lys Thr
Babi Thr Ile Pro Lys Ala
Sapi Ala Val Pro Lys Ala

Insulin manusia dan insulin babi hanya beda 1 asam amino yaitu pada B30, sedangkan insulin manusia dan insulin sapi beda 3 asam amino yaitu pada A8, A10, dan B30 sehingga pemakaian insulin babi kurang imunogenik dibandingkan insulin sapi. Tapi masalahnya, 1 babi yang diekstraksi insulinnya hanya cukup untuk 1 orang selama 3 hari padahal saat ini ada ± 60 juta orang di dunia yang menderita diabetes tergantung insulin dan diduga meningkat 5-6 % per tahunnya. Maka dari itu sekarang banyak dikembangkan teknologi rekombinan untuk mendapatkan insulin.

Keuntungan produksi insulin dengan metode rekombinan:

  1. Reliability of supply
  2. Eliminsi risiko kehadiran patogen dari hewan
  3. Cost effective

PRODUKSI INSULIN DENGAN TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN

Ada 2 cara produksi insulin dengan teknologi DNA rekombinan.

Seperti pada proses pembuatan insulin menggunakan lactose operon (gen lac Z), pembuatan insulin menggunakan bantuan β-galaktosidase juga membuat rantai A dan B secara terpisah. Ingat, terpisah dulu baru nanti digabungkan. Awalnya, gen yang menyandi baik rantai A dan rantai B digabung dengan gen β-galaktosidase. β-galaktosidase ini digunakan sebagai promotor, dengan hanya IPTG (suatu analog laktosa) maka gen β-galaktosidase akan tersintesis. Gen rantai A maupun rantai B yang berada didekatnya, tentu juga akan tersintesis. Ini adalah cara bagaimana gen rantai A tersintesis menjadi protein A.

Bila gen β-galaktosidase bertemu dengan inducer yaitu IPTG, maka gen ini akan tersintesis. Metionin dan rantai A mauoun B yang berada didekatnya akan ikut teersintesis, proses selanjutnya, sama seperti menggunakan laktose operon (Ingat, fungsi lac sama dengan β-galaktosidase).

Pada tahap terakhir, rantai A dan B akan digabungkan menggunakn proses oksidasi. Proses oksidasi berlangsung sebagai berikut:

Rantai A dan B dioksidasi, bila tidak terbentuk protein yang diinginkan maka direduksi kembali. Proses oksidasi-reduksi ini memakan waktu dan tidak efisien. Maka supaya benar-benar dihasilkan insulin dengan cara yang nudah, dilakukan teknik rekombinan yang kedua.

Gambar 5.

Teknologi rekombinan insulin yang kedua adalah menggunakan proinsulin. Seperti kita ketahui bahwa proinsulin akan langsung diubah menjadi insulin oleh enzim proteoltik (menguntungkan dan efektif). Caranya:

  1. mRNA proinsulin diubah menjadi cDNA proinsulin menggunakan enzim reverse transcriptase. Diperlukan juga sintesis kodon untuk menyandi protein. Apa tujuan diubah jadi cDNA dan sisntesis metionin?
  2. Kemudian cDNA dan kodon metionin di ligase bersama plasmid. Sebelumnya, di depan cDNA proinsulin ada gen β-galaktosidase yang berfungsi ……
  3. Di dalam gen E. Coli ini akan tersintesis menjadi protein yaitu peptida A, C (suatu fragmen internal) dan B (ingat peptida A, C, dan B adalah proinsulin, tanpa rantai C disebut insulin).
  4. CNBr akan memeotong met dan memisahkan antara β-galaktosidase dan proinsulin
  5. Proinsulin diubah secra enzimatik oleh enzim proteolitik menjadi insulin.

Gambar 6. Procedure involved in the peroduction of bioengineered human insulin in the special strains of E. Coli recombinant DNA technology using semisynthetic proinsulin gene (Method II). (From Watson et al., 1993 with permision)

PURIFIKASI INSULIN

Secara umum purifikasi insulin dapat dilakukan dengan 3 cara yaitu:

  1. Gel filtration chromatographic system (menggunakan kolom sephadex G-50)
  2. Ion exchange step
  3. Reverse Phase-HPLC

Pertama-tama, sel diambil dari fermentor lalu dihancurkan untuk mendapatkan proinsulin dalam bentuk kasar (crude proinsulin). Selanjutnya dilakukan purifikasi tahap 1 dengan kristalisasi menghasilkan proinsulin yang telah terpurifikasi sebagian. Lalu dengan proses enzimatik mengggunakan protrolisis dihasilkan crude insulin. Kemudian dimurnikan dengan ion exchange dan gel filtration. Terakhir menggunakan RP-HPLC maka akan didapatkan insulin dengan tingkat kemurnian yang tinggi.

Gambar 7. A likely purification scheme for human insulin prb*. A final RP-HPLC polishing step yields a highly pure product. *Jadi, insulin manusia itu bermacam macam: ada human insulin crb, emp, prb, pyr, Insulin BP/Eur. Ph/USP dan Insulin USP

Pada proses pemisahan insulin:

–         pH dibuat < 5,3 (di bawah pH insulin) supaya insulin tetap berada dalam larutan

–         dengan eluen gradien menggunakan asetonitril

–         dengan starting material yang kemurniannya hampir 92% maka akan didapatkan kemurnian hingga 99%.

Gambar berikut merupakan contoh hasil pemurniam insulin. Gel filtration chromatography dapat memisahkan fraksi dengan BM tinggi seperti proinsulin, insulin bentuk dimer, dan terutama enzim proteolitik dari produk insulin. Beberapa polipeptida pankreas yang memiliki BM mirip insulin juga dapat dipisahkan (Gambar 8).

Gambar 8. Chromatographic purification of recrystallized on a Sephadex G-50 gel-filtration column. Separation high-molecular-mass proteolytic enzymes, proinsulin and some very low-molecular-mass material is obvious. Insulin elutes from the column as single peak, hence the term “single peak insulin’.

Stabilitas kimia insulin

Degradasi kimia dari insulin dapat terjadi karena:

1. Transfer hidrolitik gugus amida menjadi bentuk asam yang akan menimbulkan inaktivasi insulin.

Contoh: Glutamin menjadi glutamat

Asparagin menjadi aspartat

2. Pembentukan dimer atau oligoner sehingga terjadi agregasi dan sulit terlarut pada medianya

Kecepatan degradasi insulin dipengaruhi oleh pH dan temperatur yaitu:

–         insulin mudah digredasai dalam suasan basa (insulin stabil pada pH 2,3-3,5)

–         pada temperatur > 26oC, insulin akan didegradasi

Pada kondsisi asam (pH rendah): Asn (A21) = Asparagin pada rantai A nomor 21 akan menjadi aspartat, pada kondisi ini maka potensi dari insulin akan hilang. Sedangkan pada konsisi netral Asn (B3) = Asparagin pada rantai B nomor 3 akan mengalami deaminasi menjadi asam aspartat dan asam isospartat. Namun perubahan asam amino ini tidak mempengaruhi aktivitas insulin.

Jika insulin disimpan pada suhu ±5oC maka insulin akan mengalami hanya 2% setiap tahunnya, jadi masih tetap aktif (fully bioactive).

Stabilitas fisika insulin

Secara fisika indulin dapat mengalami:

1. Agregasi nonkovalen

Hal ini terjadi karena adanaya:

–         interaksi hidrofobik

–         interaksi elektostatik

Interaksi hidrofobik terjadi karena molekul yang punya sifat hidrofob cenderung menggerombol, memisah dari molekul lain.

Interaksi elektostatik akan menyebabkan tolak-menolak atau tarik menarik antarmolekul bermuatan.

Temperatur >25oC akan mempercepat terjadinya agregasi karena protein pada suhu tinffi akan terdenaturasi san akibatnya tidak larut air. Sebaiknya juga dihindari penggojogan yang berlebihan untuk mencegah degradasi karena faktor fisis.

2. Perubahan fisis

Misalnya perubahan warna ataupun kejarnihan.

FORMULASI INSULIN

Bentuk monomer insulin merupakan bentuk yang paling aktif tapi tidak stabil dalam penyimpanan. Oleh karena itu dilakukan modifkasi supaya produk sediaan insulin tetap stabil dalam penyimpanan sebelum digunakan.

Insulin dapat membentuk dimer karena ada beberapa asam amino yang bertanggung jawab dalam pembentukan tersebut. Dimer dapat membentuk polimer tak beraturan yang dapat memicu terjadinya agregasi. Untuk itu dalam penyimpanan ditambah Zn2+ yang akan menyebabkan keteraturan bentuk molekul insulin menjadi heksamer (Hexamer T6) yang stabil. Selanjutnya ditambahkan eksipien fenolik seperti fenol dan m-kresol yang dapat berfungi sebagai preservatif dan stabilizer (Gambar 9).

Gambar 9. A schematic of the self-association of insulin

Dengan penamabahan fenol tersebut maaka bentuk heksamer T6 akan menjadi bentuk heksamer R6 yang lebih stabil. Perlu diingat bahwa fenol bersifat karrsinogenik yang poten karena dapat mengakibatkan perubahan basa AT –> GC atau GC menjadi AT. Namun karena kadar fenol yang digunakan kecil maka dapat diabaikan. Untuk meminimalkan kerusakan jaringn dan rasa sakit saat injeksi karena penambahan Zn2+ atau preservatif, maka dalam sediaan insulin sering ditambahkan agen isotonik (seperti gliserol dan NaCl) serta buffer fisiologis (seperti sodium pospat).

Insulin heksamer R6 walaupun stabil tapi tidak berefek sebagai insulin karena tidak bisa menembus memberan biologi (Gambar 10).

Gambar 10. Diagram yang menunjukkan asosiasi dan disosiasi insulin. Pada pH netral, insulin berasosiasi menjadi bentuk dimer dan heksamer. Insulin dimer dan monomer diabsorbsi lebih cepat ke dalam darah dibanding heksamer. (Diadaptasi dengan izin dari Thieme Medical Publishers)

Oleh sebab itu dalam tubuh, insulin heksamer R6 akan dipecah menjadi bentuk aktif insulin yaitu bentuk monomer-monomer (Gambar 11). Insulin heksamer akan berkesetimbangan dengan bentuk heksamer T6 yang kurang stabil, dimer, dan monomer. Tapi ternyata walaupun diberikan insulin heksamaer R dosis besar, efek yang ditimbulkan relatif kecil. Ini terjadi karena tidak semua bentuk heksamer lancar terpecah menjadi bentuk monomer sehingga hanya sedikit monomer yang dihasilkan. Bentuk dimer dan monomer dari insulin akan mempu menembus membran biologi dan menimbulkan efek walaupun konsentrasinya kecil (10-8 M).

Gambar 11. A schematic of the dissociation of a soluble human insulin hexamer after a subcutaneous injection.

Saat ini telah dikembangkan suatu formulasi insulin yang dapat memberikan aksinya dengan cepat yaitu insulin LISPRO (LysB28ProB29 hormon insulin). Insulin ini akan terpecah langsung dari heksamer menjadi monomer sehingga monomernya bisa didapat dalam konsentrasi yang lebih besar (10-3 M) sehingga cepat berefek (Gambar 12).

Gambar 12. A hypothecal schematic of the dissociation of soluble insulin lispro hexamer after a subcutaneous injection.

Contoh formulasi insulin bisa disimak dalam tabel berikut (Tabel 2).

Tabel 2

A list of neutral human U100 insulin formulations

Yang membedakan preparat-preparat insulin adalah senyawa tambahan yang diberikan dalam formulasi. Contohnya pada NPH (Neutral Protamine Hagendorn) yaitu ada protamin yang lebih bisa menstabilkan bentuk heksamer R6 sehingga pelepasan insulin lebih lambar (aksinya lebih lama).

Lente: campuran dari 70% ultralente (rhombohedral) dan 30% semilente (amorphous).

MODIFIKASI INSULIN

Modifikasi insulin dapat dilakukan dengan membuat analog insulin misalnya dengan site directed mutagenesis. Ada beberapa cara yang dapat dilakukan:

1. Insulin yang mudah berikatan dengan reseptornya dimodifikasi pada asam amino yang terikat pada reseptor binding site-nya (A1, A5, A21, B10, B16, B23-25 merupakan reseptor binding site pada insulin). Contoh: glutamat pada rantai B nomor 10 diubah menjadi histidin maka akan menaikan aktivitas 5 kali lipat.

2. Mengubah asam amino yang dapat mempengaruhi profil farmakokinetik insulin yang beraksi dengan cepat ada insulin yang long acting, dan lain-lain. Contoh: pembentukan dimer-oligomer dengan mengubah asam amino B8, B9, B12-13, B16, dan B23-28 dapat meningkatkan t ½ sampai 35 jam, sehingga 1 kali injeksi insulin dapat untuk 1 hari.

Untuk modifikasi yang lain, simak di tabel 3 berikut !

Tabel 3

Insulin manusia dan analognya

Insulin A21 B3 B28 B29 B31 B32
Human Asn Asn Lys Pro
Lispro Asn Asn Pro Lys
Aspart Asn Asn Asp. Acid Pro
Glulisine Asn Lys Lys Asp. Acid
Glargine Gly Asn Lys Pro Arg Arg
Detemir Fatty acid at  B29 and  B30 removed

Faktor yang mempengaruhi aksi insulin:

1. Dosis

Semakin tinggi dosisnya maka semakin cepat aksinya.

2. Tempat injeksi

Pada umumnya insulin diberikan dengan injeksi menembus kulit. Pada pemberian intravena aksinya cepat, pad transdermal atau secara subkutan maka pada otot terjadi degradasi insulin 20-25%. Makanya harus diperhitungkan untuk mendapatkan dosis yang tepat. Kebanyakan insulin diinjeksikan pada perut (intrperional). Jarum untuk injeksi insulin kecil sekali dan pendek (0,5-1 cm). Dapat juga menggunakan implant pad dada yang dapat mensuplai insulin sedikit demi sedkit.

3. Kehadiran antibodi insulin

Hal ini terutama pada penggunaan hewan sebagai insulin. Jika digunakan insulin dari luar dikhawatirkan terjadi reaksi antigen antibodi maupun perusakan lain, kecuali pada penderita autoimun.

4. Aktivitas fisik

Semakin banyak aktivitas fisik yang kita lakukan maka kita perlu energi  (dari glukosa) yang semakin besar sehingga tidak perlu aksi insulin yang ekstra untuk mengubah glukosa menjadi glikogen (insulin yang diperlukan semakin sedikit).

Tabel 4

Karakteristik farmakokinetik: pendek, intermediet dan long-acting sediaan insulin

Kategori Onset (jam setelah pemberian) Aktivitas puncak (jam setelah pemberian) Durasi (jam)
Aksi pendek 0,5-1 2-5 6-8
Aksi menengah 2 4-12 Sampai 24
Aksi lama 4 10-20 Sampai 36

Pemberian insulin:

– short acting              : diberi 0,5-1 jam sebelum maakan

– intermediet acring   : diberi 2 jam sebelum makan

– long acting               : diberi 4 jam sebelum makan

Pemberian preparat insulin perlu diatur seperti di atas supaya saat kadar glukosa dalam tubuh tinggi (mencapai puncak) maka kadar insulin juga sudah tinggi, jadi harus seimbang.

–         jika kadar insulin tinggi kadar glukosa darah rendah maka akan terjadi shock.

–         Jika kadar insulin rendah tetapi kada glukosa darah tinggi maka terjadi kelebihan gula (diabetes).

Penutup

Dengan adanya teknologi DNA rekombinanan diharapkan harga insulin menjadi tidak mahal lagi.

Catatan kuliah tanggal 23 November 2007 (Hem…rajin banget dulu brarti ya..)

Author: admin

menebar ilmu pengetahuan

One thought on “Terapi Untuk Defisiensi Insulin

  1. Pingback: FAQ : Insulin « greenteatnite

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s